微生态制剂在水产养殖中研究现状

近年来，水产养殖在国际与国内大环境下，逐步从粗放式养殖过渡为规模化、集约化养殖，水产养殖种类日益增加，养殖产量也极大提升[1]。但是随着水产养殖行业欣欣向荣，迎来快速发展的同时，养殖水体污染情况较为严重，生态大环境遭到不同程度损坏，从而致使水生动物疾病频频出现。抗生素因其使许多致病菌体产生相应耐药性、二次污染水体及兽药残留等因素，已于2019年由国家有关部门明令禁止养殖行业使用抗生素。由于微生态制剂安全环保，没有药物残留和水体污染，且能净化水体、改善肠道微生物菌群、提高饲料利用率、进而增强水产动物抗病力，从而直接提升水产养殖经济效益，因此微生态制剂已经成为替代抗生素应用养殖业重要选择之一，合理的选择和正确使用微生态制剂将是未来水产养殖业的重点，微生态制剂作为一种“绿色”添加剂被越来越多的学者所密切关注着[2]。国际上美国饲料公定协会（AAFCO）公开发表了44种“可直接饲喂且安全的微生物”作为微生态制剂的菌株，主要有酵母（Yeast）、细菌（Bacteria）和真菌（Fungi）。

1.1 微生态制剂定义

微生态制剂（Probioties），又称为微生态调节剂（Microecological regulator）是指在微生物学理论的参考下，利用对宿主有益的健康微生物、保持宿主微生物平衡，提高其健康水平的微生态活菌制品及其代谢物质，以及促进这些有益微生物生长繁殖的物质，经过特殊工艺加工制作而成的生物制剂[3]。

1.2 微生态制剂分类

大多数学者普遍认同微生态制剂的两种分类方法，分别是按照其组成成分和构成的菌种分类。

1.2.1 微生态制剂按照组成分类

主要分为：益生菌、益生元、合生元。

① 益生菌：或称为益生素（Probiotics），指投入机体消化道后，进入肠道通过增加有益菌群数量，从而改善机体肠道菌群微生态平衡而发挥其有效作用，达到增加机体（人或动物）免疫能力和健康水平的活菌制剂及其代谢副产物[4]。近年来，国内外学者开发出多种益生菌活菌制剂，基本原理是通过筛选出人或动物原有的健康生理菌群成员，再经过人工繁殖扩增，特殊工艺制备相应剂型制作成活菌制剂，之后再以投入方式让其回到原来的微生物环境中，发挥应有的生理作用。益生菌根据效用可分为：具备防控病原微生物的益生菌、增进动物免疫力的益生菌、促进动物生长能力的益生菌、改良水质的益生菌。

② 益生元：通俗的讲，是益生菌增殖的养料。益生元（Probiotics）是指不容易被动物消化道消化，或大部分不被消化，而是被肠道有益菌群所吸取消化。可以选择性的刺激宿主肠道内自身有的单个或数个有益菌群增殖与活性的制剂。从而达到调节肠道微生物，增加机体非特异性免疫能力，改善宿主健康的目的。双歧杆菌和乳酸菌被公认为是对人或动物肠道的有益菌，所以一般的益生元被认为是能促进这两种菌数量增长或活性加强的物质。可以增加双歧杆菌数量、活性的物质被称为双歧因子[5]。益生元主要是各类寡糖物质。目前在动物营养添加剂上常用到的有：甘露寡糖（Mannan oligosaccharide）、β-葡聚糖（Beta glucan）、反式半乳寡糖（TOS）、果寡糖（FOS）、乳果糖（Lactulose）等。这些糖类既不被动物消化系统消化，亦不被肠道别的菌群分解应用，只能为肠道有利菌群（如乳杆菌或双歧杆菌等）利用，增进有益菌的生长与活性，克制有害菌的增殖生长，从而达到调理肠道微生物菌群的效果。此外，部分有机酸、盐类及中草药类也能起到益生元的生理性效果，如葡萄糖酸、葡萄糖酸钙、蒲公英、灵芝、黄芪等。

③ 合生元：又称为合生素（Synbiotics），王雪飞等[6]指出益生菌和益生元按照适当比例结合的制剂，其本质不是成分简单的叠加，而是质的提高。此类制品是以益生菌和益生元并用，动物经服用后到达肠道可使进入的益生菌与机体原有的益生菌在益生元的作用下，进行更好的定植、扩增，使有益菌占据绝对优势，从而调节肠道微生物菌群，增强宿主免疫力。目前高效合生元产品的应用研发在国内外的营养领域中正逐渐成为焦点。其主要用于改善机体肠道生理性功能，增强动物的存活率、生长性能和抗病力，其次用于预防或治疗部分疾病。此类制剂已经在我国面市，并有逐渐增多的趋势。

1.2.2 微生态制剂按照所属菌种分类

主要分为：乳酸菌类制剂、酵母菌类制剂、芽孢杆菌类制剂、光合细菌类制剂和复合微生态制剂。

① 乳酸菌类制剂：乳酸菌（Lactobacillus）泛指一类能够利用碳水化合物的发酵及其代谢产物主要为乳酸的革兰氏染色阳性细菌的通称。乳酸菌因其对动物或人肠道有明显的保健作用，而得以最早使用以及推广。20世纪初期，俄国生物学家Mechnikoff 在评获诺贝尔生理奖中指出保加利亚地区居民长寿的重要原因：“乳酸菌能够完整进入人体肠道并定植，显著地抑制有害菌的繁殖，降低由于肠道内有害菌产生的毒素对宿主的损伤。”乳酸菌对酸性环境有很高的耐受性，因而能够顺利在动物肠道定植，但是高温易失活，所以其相关产品功效不稳定，需要加强工艺保证产品质量。乳酸菌类制剂是将乳酸菌在适宜条件下培养、发酵而出现的其代谢产物及其培养液，再进行干燥处理等加工制成的对宿主具有调节肠道微生物菌群作用的制剂[7]。乳酸菌类制剂主要功能：产生乳酸进而降低环境酸碱度，分泌出抑菌素，抑制有害菌生长对机体造成损害；为宿主供应氨基酸、多维及未知生长因子等营养物质，增进机体生长；产生并激活机体各类消化酶，提高饲料利用率；引发机体分泌一些细胞因子，增进机体非特异性免疫能力；改良水质；对厌氧菌活性有增强作用，对耗氧菌活性有克制作用。乳酸菌种类居多，在水产养殖应用较多的有嗜酸乳杆菌、短小乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌等。

② 酵母菌类制剂：酵母菌（Yeast）在有氧或无氧条件下均能生存，属于兼性厌氧菌，广泛存在于空气中、水中、土壤中以及动物体内。它含有丰富的营养物质，为机体提供优质蛋白，保护有益菌增殖，抑制有害菌的生长，调控肠道微生物菌群，增强机体免疫能力。进而增进动物的生长发育，减短饲养周期，提高增重率，减少养殖死亡率，改良肉质和提高瘦肉率，并能明显增强幼禽畜的抗病力。酵母类制剂主要有酵母提取物、酵母细胞壁和酵母培养物等产品，其蛋白含量高、营养物质均衡、具有保健预防疾病功能且工厂化生产效率高，是常用的微生物饲料添加剂[8-9]。

③ 芽孢杆菌类制剂：芽孢杆菌（Bacillus）是菌体内存在一个芽孢的革兰氏阳性菌，广泛存在于动物体肠道内，生命力极强，有效抑制有害菌增殖。由于芽孢具有特殊的多层结构与高含量吡啶二羧酸，所以折光性强、不易被染色，芽孢对热、干燥、酸碱、含氯消毒剂以及其他外界因素有较强的抵抗力[10]。芽孢杆菌作为水产类动物微生态饲料添加剂，相比较于使用乳酸菌类、酵母菌类制剂起步晚，但随着近几年应用研究，因其独特的优势受到了学者的关注。芽孢杆菌制剂较其他菌类制剂明显的优势，如稳定性强、不易变性，在饲料加工的过程保证品质；储藏时以孢子形式存在，损耗少；可以稳定的通过胃部进入前肠，存活率近乎100%；繁殖快，生长周期短，个体较大；分泌消化酶不仅增加饲料利用率，其中还包括具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，可以分解植物饲料细胞壁，使其暴露出营养物质被充分消化吸收。现在应用较多的是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。因其优良特点，芽孢杆菌及其相关产品在我国水产养殖业被逐渐重视。

④ 光合细菌类制剂：光合细菌（Photosynthetic bacteria）是具备光能应用体系的原核生物，在低氧光照环境下代谢有机物作为供氢体与碳源进行光合作用的细菌。另外，光合细菌含有碳素贮存物质糖原、辅酶Q、生长因子，具备优良的饲料价值，在养殖业有广阔的发展空间。在水产行业可以作为饲料添加剂，增进鱼类对饲料的消化吸收，增加饲料利用率，可显著提高鱼的生长速度，且具有代谢水体中的亚硝酸盐、硫化物等有毒物质，实现充当饵料、净化水质等功能。在水产养殖中使用较多的是光能异养型红螺菌科中的一些品种，如紫色非硫细菌。利用光合细菌作为开口饵料，可大幅增加鱼苗成活率。在养殖水体添加光合细菌后，可以培育硅藻、小球藻等有益藻类，而蓝藻等有害藻类受到克制。刘中等[11]在鲤鱼饵料中添加光合细菌，发现添加光合细菌实验组鲤鱼成活率与增重率明显增加。郑耀通等[12]通过净化模拟养殖水质试验，得出水体中固定化光合细菌可显著提高氨根离子和COD的降解率，并能增加溶解氧，相应的鱼成活率高、体质好。大量研究表明，光合细菌类制剂对鱼虾动物具有保健成效。

⑤ 复合微生态制剂：复合微生态制剂（Compound microecological preparation）是指使用两种或两种以上益生菌并且按照一定比例混合使用的微生物制剂。理论上复合微生态制剂包含有益菌种类多，应具有所包含单一益生菌的有益效果。大多数研究者由于单一菌种使用机制明确而更加青睐，对于复合菌种添加种类、比例、剂型等问题在试验设计与应用上需要大量基础研究逐步验证，并且应用效果在一定程度存在投机性。单一的益生菌制剂在理论上应用效果要弱于复合制剂，Merrifield等[13]研究证实混合使用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌作为虹鳟饲料添加剂饲喂10周后，饲料效率、特定增长率显著高于单一使用益生菌。同样的，Yanbo等[14]发现混合使用枯草芽孢杆菌、光合细菌饲喂鲤鱼，生长性能、饲料效率及消化酶活性等综合性能要强于单一使用益生菌实验组。但是也有研究表明复合制剂效果差于单一菌种制剂，袁成玉等[15]在幼刺参饲料中分别添加光合细菌、芽孢杆菌和复合菌（光合细菌和芽孢杆菌）三种微生态制剂，结果显示添加益生菌组均显著提升幼刺参生长性能，但单一添加益生菌组效果要优于复合制剂，造成这样的结果可能涉及不同菌种添加配伍、剂量等因素。综上表明，复合微生态制剂作为动物饲料添加剂应用上在某些因素下效果不一定强于单一益生菌添加剂，其本质原因，复合微生态制剂作为添加剂发挥生理性作用，要确保完整进入肠道，且与各菌群比例、相互作用以及动物种类、所处环境均有关系，其作用机制需科研人员进一步的完善。

2.1 微生物拮抗论

微生物颉颃（Microbial Interference）是指微生物之间相互抗争、相互排斥、甚至相互厮杀的斗争现象。多指正常的微生物（厌氧菌）在肠道为宿主健康构建的防御屏障，对侵入的致病菌有生物颉颃作用。

微生物能够产生颉颃作用，主要依赖益生菌及其多种代谢物质的相互作用，首先，厌氧菌可以通过无氧呼吸作用产生有机酸类，降低宿主肠道酸碱度，促进胃肠道蠕动，从而抑制外来病原菌活性，清除外籍菌；机体肠道内微生物菌群通过位点黏附在肠壁上，有益菌与宿主肠道黏膜上皮细胞紧密结合形成“占位”性竞争抑制有害菌生长，Pan等[16]研究证实酪酸梭状芽孢杆菌在宿主肠道可以竞争性抑制嗜水气单胞菌和鳗弧菌的黏附位点而增强宿主免疫力。Collado等[17]研究结果表明乳酸菌结合肠壁能力比大肠杆菌和沙门氏菌具有更好的黏附性，达到竞争性抑制大肠杆菌和沙门氏菌活性，从而保护宿主健康系统；有益菌在特定条件下，数量上占优势，在微生物营养需求上竞争性抑制有害菌的生长，王华等[18]发现酿酒酵母通过竞争性需求磷脂受体而对大肠杆菌和卷旋菌的增殖产生抑制作用，类似的，Zhang等[19]发现铜绿假单胞菌能够产生铁载体，铁载体特异性结合铁离子，抑制对铁离子需求较高的有害菌生长；有益菌可以分泌出细菌素、乙醛等抗菌物质来抑制或杀死有害菌，An等[20]从一株分离自石斑鱼的芽孢杆菌发现其分泌一种新型细菌素CAMT2，它对副溶血弧菌、李斯特氏菌等有害菌具有显著性抑制作用。

2.2 微生物夺氧论

生物夺氧是指机体肠道内耗氧菌或兼性厌氧菌先定植和生长消耗氧气，为厌氧菌定植、生长营造低氧，甚至无氧的环境，之后大多数益生菌（厌氧菌）逐渐繁殖，占据数量上绝对优势，并调节宿主肠道微生物平衡，达到增强机体免疫力的作用。

2.3 三流运转论

正常的微生态菌群存在能量流动、物质交换及基因传递的现象，微生态制剂可以作为免疫调节因子来确保有益菌群之间能量流、物质流、基因流的有效运转，进而保护宿主肠道健康安全。

2.4 营养物质合成论

机体正常的微生物菌群中有益菌在肠上皮定植繁殖后，会分泌多种有利于机体生长的物质，如维生素B、辅酶Q、生长刺激因子及多种消化酶类等，协同宿主内源性消化酶共同提高饲料的利用率，从而更好的确保机体的生长。另外，大部分有益菌本身及其代谢产物富含丰富的营养元素，例如啤酒酵母菌中含有优质的蛋白质、寡糖类、维生素、晒等微量元素；芽孢杆菌定植后可以分泌淀粉酶、复杂蛋白酶等消化酶，可以分解植物细胞壁，使肠上皮细胞更高效的吸收营养成分。

2.5 肠道免疫保护论

肠道微生物（有益菌）通过与黏膜免疫系统相互作用，调控小肠上皮与黏膜组织的生长、代谢及炎症缓解。肠道黏膜具有免疫信号激活的模式识别受体（PRRS），有细胞外膜Toll样受体、甲酰化多肽受体以及胞内NOD样受体（NLRS），它们能够特异性的识别并结合微生物相关分子模式（MAMPS）配体，包括脂多糖、鞭毛、肽聚糖及甲酰化多肽（见图1）[21]。微生物（益生菌）配体与黏膜免疫受体长期相互作用使宿主产生免疫耐受，即配体与受体结合，不激活免疫应答，从而使有益菌群及其共生菌群能够稳定生长。益生菌及相关代谢产物能够竞争性抑制有害菌及病原微生物在肠道黏膜上皮细胞结合受体位点，减少有害微生物在肠道黏附、扩增以及免疫应答。

PRRS的激活能够调控核转录因子NF-κB信号通路、蛋白激酶MAPK信号通路以及细胞凋亡蛋白酶依赖的信号级联反应产生的细胞因子、趋化因子进而引起细胞凋亡。细胞因子分为促炎因子IL-8、IL-1B、TNF-α等，抗炎因子IL-10、IL-15等。其中NF-κB被认为是炎症反应调控的非常重要的一类因子，能够调控一系列细胞因子表达，如TNF-α、IL-8、IL-10、IL-6等[22]。MAPK同样发挥着重要作用，相应的PRRS结合后，通过P38、EPK、JNK磷酸化来激活免疫应答产生炎症细胞因子。由病原菌或其他应激引起的机体炎症或细胞凋亡，其背后是NF-κB信号通路以及细胞凋亡蛋白酶级联反应来进行调控。大部分益生菌能够阻止NF-κB的负调节因子IκB的降解，或者通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）依赖的信号通路将NF-κB亚基p65从细胞核输出从而抑制免疫应答。益生菌还能够诱导转化生长因子-β（TGF-β）信号通路和MMP3K信号通路，介导细胞抗炎作用[23]。Bu等[24]通过对乌苏里拟鲿饲料中添加微生态制剂酵母培养物（YC）饲喂八周，结果表明，添加YC组下调了TLR2-MyD88-NF-κB信号通路、IL-1β、IL-8的基因mRNA表达、上调了IL-10的mRNA表达，显著性增加了补体C3、C4和免疫球蛋白IgM含量，得出添加酵母培养物能够增强乌苏里拟鲿免疫力的结论。主要因为微生态制剂作为饲料添加剂，与机体相互作用提高宿主免疫能力，可以调节细胞因子、干扰素的表达，激活淋巴细胞、NK细胞，溶菌酶活性增强，从而保护机体对抗有害菌，类似的，程鑫等[25]发现黄颡鱼饲料中添加酵母培养物能够提高嗜水气单胞菌攻毒试验成活率，肠道形态学表现更为健康。

微生态制剂在水产饲料应用最早报道见于虹鳟（Oncorhynchus mykiss）饲料添加鼠李糖乳杆菌JCM1136，与对照组相比，添加益生菌组免疫球蛋白水平呈上升趋势，宿主免疫力更强[26]。在虾类试验最早在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）饲料中添加中芽孢杆菌，结果显示，伴随着芽孢杆菌含量增加，虾的存活率和免疫参数总体呈上升趋势，而肠道有害弧菌数呈下降趋势[27]，随后在水产养殖中应用增多。水产养殖应用微生态制剂主要分为两类，分别是饲用微生态制剂与调水改底用微生态制剂，具有净化水质、调节宿主肠道微生物群落、提高消化能力、促进动物生长、提高免疫相关基因的表达水平、增强机体抵抗病毒、细菌感染的能力[28-31]。

水产饲用微生态制剂继在虹鳟与凡纳滨对虾报道后，又出现了对其他经济性鱼类的应用，有军曹鱼（Rachycentroncanadum）、大黄鱼（Larimichthyscrocea）和甲壳动物，有日本对虾（Penaeusjaponicus）、欧洲龙虾（Homarusgammarus）等的效果的研究发表[32-35]。2012年后，微生态制剂在水产应用迎来了爆发式发展，尤其是在探究益生元与益生菌的配伍优化对多种水产养殖动物的生长性能、存活率、免疫应答、抗病能力、肠道健康等方面的应用研究。其中在虹鳟应用研究上，Rodriguez-Estrada等[36]发现甘露寡糖（MOS）与灭活粪肠球菌（Enterococcus faecalis）配伍能显著提高其生长性能与免疫保护作用。Seyed Hossein等[37]发现低聚半乳糖（GOS）与乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）混用能显著性提高其生长性能、存活率、肠道有益菌群、免疫能力和抗链球菌病害能力。观赏鱼类中也有报道应用微生态制剂，锦鲤（Cyprinus carpio）[38]、神仙鱼（Pterophyllum scalare）[39]，软体动物，如耳鲍（Haliotis Asinine）饲料中添加益生菌弧菌Abn1.2-Alg3.1提高其生长率、营养状况[40]。微生态制剂在水产养殖因其效果应用广泛，但是面临针对性微生态制剂的短缺，缺乏配伍益生菌协同作用研究和自主筛选的菌株及储藏技术，制作工艺落后等一系列问题，中国水产微生态制剂的发展需要顺应新时代的绿色健康要求和科学性的技术指导。

微生态制剂在水产领域应用起步较畜禽类晚，但是发展迅速。今后微生态制剂发展趋势会向以下几方面发展：高效、针对性强的微生态制剂，作用效果更为显著；基因工程技术构建易生产、保存、繁殖、稳定的优势菌株；按照相应配比开发多功能复合微生态制剂，使其同时具有改善肠道内环境、增加进食、抑制有害菌群、改善水质等多方面的作用。微生态制剂不仅能改良水质，而且能有效地防治疾病并且无污染，达到生态防治的目的。因此，以微生态制剂代替抗生素，将成为水产动物饲料添加剂的重要研究方向。